CTC College

CTC學(xué)院

在傳統(tǒng)臨床實(shí)踐中,獲得腫瘤患者組織樣本只有手術(shù)活檢和穿刺活檢兩種。轉(zhuǎn)移期腫瘤患者體內(nèi)可能有多個(gè)腫瘤病灶，具體到從哪個(gè)病灶獲取腫瘤組織樣本是一大問題。

腫瘤患者血液中存在少量循環(huán)腫瘤細(xì)胞以及由壞死癌細(xì)胞釋放的少量循環(huán)腫瘤 DNA。通過檢測血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC，circulating tumor cell）和循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA，circulating tumor DNA）對(duì)患者腫瘤進(jìn)行診斷與監(jiān)測的方法被稱為液體活檢。相比于傳統(tǒng)的活檢方法，液體活檢具有副作用小、操作簡單、能重復(fù)取樣等優(yōu)點(diǎn)。

Credit: H. McDonald/Science Translational Medicine

最新研究證實(shí)，除了從已形成的實(shí)體瘤病灶（原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶）脫落進(jìn)入血液外，腫瘤細(xì)胞在形成實(shí)體瘤病灶之前便有可能進(jìn)入血液系統(tǒng)中，由此提示循環(huán)腫瘤細(xì)胞的存在往往要早于影像學(xué)或臨床癥狀的表現(xiàn)。

近幾年CTC檢測在腫瘤輔助診斷、監(jiān)控等方面的臨床表現(xiàn)逐漸嶄露頭角，是目前最具發(fā)展?jié)摿Φ哪[瘤無創(chuàng)診斷和實(shí)時(shí)監(jiān)測手段之一。大量實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)CTC檢測有助于腫瘤的早期診斷、預(yù)后評(píng)估、療效監(jiān)測及個(gè)體化治療方案制定等。

redit:Catherine Alix-Panabieres et al.
Clinical Chemistry. 2013;59(1):110-118.

CTC--腫瘤標(biāo)志物

   2007年ASCO將CTC納入腫瘤標(biāo)志物。

CTC被多個(gè)指南認(rèn)可

2010年 美國AJCC《腫瘤分期指南》（第七版）

首次把CTC列入TNM分期系統(tǒng)，作為一個(gè)新的M分期（遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移）標(biāo)準(zhǔn)，列為

cM0(i+)分期，出現(xiàn)在M0和M1之間。

2017年 美國NCCN乳腺癌臨床實(shí)踐指南

正式引入cM0(i+)分期。

2018年 美國AJCC《腫瘤分期指南》（第八版）

明確CTC為乳腺癌預(yù)后評(píng)估工具之一：臨床晚期乳腺癌外周血CTC≥5個(gè)/7.5ml及臨床早期乳腺癌外周血CTC≥1個(gè)/7.5ml提示預(yù)后不良。

2018年 中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì)/國家衛(wèi)生健康委員會(huì)臨檢中心

《液體活檢在臨床腫瘤診療應(yīng)用和醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)踐中的專家共識(shí)》

CTC檢測可用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、乳腺癌與前列腺癌的進(jìn)展/不良預(yù)后早期預(yù)警。

2019年 中國CSCO《乳腺癌診療指南》

CTC能夠反映腫瘤組織的情況，也可以用無創(chuàng)方式替代組織樣本進(jìn)行病理診斷、疾病監(jiān)測、分子測序等，不僅可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測，還可以用于判斷預(yù)后。

CTC檢測可用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、乳腺癌與前列腺癌的進(jìn)展/不良預(yù)后早期預(yù)警。

左圖：結(jié)直腸癌中間質(zhì)表型的CTC預(yù)示著疾病更惡性與轉(zhuǎn)移潛能更強(qiáng)。

Zhao R, et al. Oncotarget. 2017 Feb 7;8(6):9293‐9302.

右圖：上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）表型CTC是乳腺癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的潛在生物標(biāo)志物。

Zhang S, Wu T, et al. Cancer Manag Res. 2017 Nov 23;9:691‐700.

目前CTC的應(yīng)用主要在以下幾個(gè)方面：
1. 在常規(guī)手段無法對(duì)早期腫瘤進(jìn)行判斷時(shí)進(jìn)行輔助診斷。
2. 在伴隨診斷、療效評(píng)估方面，癌癥患者進(jìn)行化療、靶向治療后進(jìn)行CTC 檢測，若CTC 數(shù)量減少，提示治療方式可能有效。相比于現(xiàn)階段的檢查手段，CTC 檢測技術(shù)操作更方便，應(yīng)用更簡單，可以更及時(shí)地提示醫(yī)生該患者是否適合化療或靶向治療。
3. 在術(shù)后監(jiān)測方面，主要是由于活檢無法高頻次檢測，而目前CTC 檢測在術(shù)后監(jiān)測中應(yīng)用可能更方便，檢測頻次會(huì)更高。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）的特性
1. 稀有性：每10mL血液中可能僅含有幾個(gè)到幾十個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞。
2. 非典型性的細(xì)胞形態(tài)：一般比血液細(xì)胞，正常組織細(xì)胞體積大；細(xì)胞核大，不規(guī)則，細(xì)胞核質(zhì)比高；不易發(fā)生變形。
3. 異質(zhì)性：細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物表達(dá)差異，攜帶不同的分子信息，轉(zhuǎn)移潛力差異。
4. 不同類別：CTC可以是間質(zhì)型、上皮型或者上皮間質(zhì)混合型，CTC也既可以是單個(gè)細(xì)胞的CTC也可以是成團(tuán)的CTCs(CTM)。

CTC富集和檢測方法

人體循環(huán)系統(tǒng)中CTC的含量極低,腫瘤轉(zhuǎn)移患者每毫升全血中僅有1～10 個(gè)CTC，因此要實(shí)現(xiàn)CTC的檢測對(duì)其進(jìn)行分選富集是一個(gè)必不可少的步驟。CTC分選富集效果的優(yōu)劣將會(huì)直接影響其后續(xù)的檢測(計(jì)數(shù)、基因擴(kuò)增、基因測序等)效果,因此高純度、高靈敏性(不丟失CTC)、快速、高細(xì)胞活性的CTC分選富集是CTC臨床應(yīng)用的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

CTC 的富集方法可以分為免疫親和富集法和物理特性富集法。免疫親和法主要是根據(jù)細(xì)胞表面表達(dá)的特異性的蛋白將CTC篩選出來，物理特性富集主要是根據(jù)CTC 的大小和密度等特性將這些細(xì)胞篩選出來。微流控芯片技術(shù)憑借多種優(yōu)勢已經(jīng)在CTC富集分選中得到越來越廣泛的應(yīng)用，有望在將來成為CTC富集和檢測工具之一。

利用免疫親和或物理特性法可富集到CTC，接下來還需要結(jié)合有效的下游分析方法。一方面，由于目前CTC捕獲技術(shù)不能保證百分之百的純度，需要對(duì)所得到的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，以進(jìn)一步確定CTC細(xì)胞的數(shù)目，以減少CTC數(shù)目判定的假陽性率和假陰性率。另一方面，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，不僅CTC的數(shù)目在動(dòng)態(tài)的變化，CTC所攜帶的分子標(biāo)志物也在變化，通過對(duì)CTC表面標(biāo)志物檢測，能夠反應(yīng)腫瘤發(fā)生發(fā)展的動(dòng)態(tài)變化，是研究腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的有效策略，并能很好地指導(dǎo)臨床治療。

常用的CTC檢測技術(shù)如免疫熒光、PCR、FISH及高通量測序等。
1. 免疫熒光法（IF）: 實(shí)體腫瘤細(xì)胞一般均為上皮來源，細(xì)胞內(nèi)會(huì)表達(dá)角蛋(cytokeratin, CK)或其他腫瘤標(biāo)示物(如HER2)。借助免疫熒光染色，可對(duì)來自實(shí)體瘤CTC中的瘤標(biāo)進(jìn)行識(shí)別，從而達(dá)到檢測CTC的目的。這也是目前檢測CTC的最常見方法。缺點(diǎn)是，在CTC形成過程的間質(zhì)化(EMT)階段，大量的CK會(huì)降解，從而在CTC檢測過程中出現(xiàn)假陰性。
2. 熒光原位雜交（FISH）: 熒光原位雜交，是根據(jù)已知細(xì)胞內(nèi)特異的DNA序列，以利用熒光標(biāo)記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，與細(xì)胞內(nèi)的基因組中DNA分子雜交，檢測該特異基因序列的存在與豐度。FISH技術(shù)與CTC結(jié)合，不僅可以檢測CTC表面標(biāo)志物，也可以檢測CTC細(xì)胞內(nèi)部的標(biāo)志物及核型等。
3. RT-PCR，反轉(zhuǎn)錄PCR: 提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用引物和逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。結(jié)合RT-PCR可同時(shí)對(duì)若干個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)行檢測。位點(diǎn)特異性PCR技術(shù)可用于檢測CTC攜帶的驅(qū)動(dòng)基因的突變情況。
4. 二代測序 : CTC數(shù)量少，直接進(jìn)行二代測序難度大。需要將單細(xì)胞的DNA擴(kuò)增后，再利用二代測序檢查基因序列。但是，目前單細(xì)胞測序的技術(shù)僅僅停留在實(shí)驗(yàn)室階段，未來向市場推廣還有很長的路要走。而且由于腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，單細(xì)胞測序是否有代表性還需要更多的科學(xué)研究來證明。

CTC技術(shù)概述