CTC College
CTC學院
在傳統(tǒng)臨床實踐中,獲得腫瘤患者組織樣本只有手術活檢和穿刺活檢兩種。轉移期腫瘤患者體內可能有多個腫瘤病灶，具體到從哪個病灶獲取腫瘤組織樣本是一大問題。
腫瘤患者血液中存在少量循環(huán)腫瘤細胞以及由壞死癌細胞釋放的少量循環(huán)腫瘤 DNA。通過檢測血液中的循環(huán)腫瘤細胞（CTC，circulating tumor cell）和循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA，circulating tumor DNA）對患者腫瘤進行診斷與監(jiān)測的方法被稱為液體活檢。相比于傳統(tǒng)的活檢方法，液體活檢具有副作用小、操作簡單、能重復取樣等優(yōu)點。
Credit: H. McDonald/Science Translational Medicine
最新研究證實，除了從已形成的實體瘤病灶（原發(fā)灶、轉移灶）脫落進入血液外，腫瘤細胞在形成實體瘤病灶之前便有可能進入血液系統(tǒng)中，由此提示循環(huán)腫瘤細胞的存在往往要早于影像學或臨床癥狀的表現。
近幾年CTC檢測在腫瘤輔助診斷、監(jiān)控等方面的臨床表現逐漸嶄露頭角，是目前最具發(fā)展?jié)摿Φ哪[瘤無創(chuàng)診斷和實時監(jiān)測手段之一。大量實驗已經證實CTC檢測有助于腫瘤的早期診斷、預后評估、療效監(jiān)測及個體化治療方案制定等。
redit:Catherine Alix-Panabieres et al.
Clinical Chemistry. 2013;59(1):110-118.
CTC--腫瘤標志物
2007年ASCO將CTC納入腫瘤標志物。
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腫瘤診斷方法 |
優(yōu)點 |
缺點 |
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影像學 |
①較快速
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①特異性不足 ②對病灶大小有要求 ③結果普遍存在滯后性 ④射線對身體有損傷 |
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病理學 |
①診斷金標準
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①取樣會帶來創(chuàng)傷和擴散風險 ②很多早期患者無法取樣或取樣不足。 |
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血清標志物 |
①自動化檢測，費用低廉 ②適用于大眾篩查 ③可為影像學提供參考數據 |
①有些腫瘤沒有特異性的血清學標志物 ②假陽性 ③特異性不足 |
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循環(huán)腫瘤細胞（CTC）檢測 |
①非侵入性 ②可定性和定量 ③高敏感性、高特異性 ④好的腫瘤轉移指標 ⑤可實時動態(tài)監(jiān)測 ⑥檢測診斷窗口提前 |
檢測費用較高 |
CTC被多個指南認可
2010年 美國AJCC《腫瘤分期指南》（第七版）
首次把CTC列入TNM分期系統(tǒng)，作為一個新的M分期（遠端轉移）標準，列為
cM0(i+)分期，出現在M0和M1之間。
2017年 美國NCCN乳腺癌臨床實踐指南
正式引入cM0(i+)分期。
2018年 美國AJCC《腫瘤分期指南》（第八版）
明確CTC為乳腺癌預后評估工具之一：臨床晚期乳腺癌外周血CTC≥5個/7.5ml及臨床早期乳腺癌外周血CTC≥1個/7.5ml提示預后不良。
2018年 中華醫(yī)學會檢驗醫(yī)學分會/國家衛(wèi)生健康委員會臨檢中心
《液體活檢在臨床腫瘤診療應用和醫(yī)學檢驗實踐中的專家共識》
CTC檢測可用于轉移性結直腸癌、乳腺癌與前列腺癌的進展/不良預后早期預警。
2019年 中國CSCO《乳腺癌診療指南》
CTC能夠反映腫瘤組織的情況，也可以用無創(chuàng)方式替代組織樣本進行病理診斷、疾病監(jiān)測、分子測序等，不僅可以動態(tài)監(jiān)測，還可以用于判斷預后。
CTC檢測可用于轉移性結直腸癌、乳腺癌與前列腺癌的進展/不良預后早期預警。
左圖：結直腸癌中間質表型的CTC預示著疾病更惡性與轉移潛能更強。
Zhao R, et al. Oncotarget. 2017 Feb 7;8(6):9293‐9302.
右圖：上皮間質轉化（EMT）表型CTC是乳腺癌遠端轉移的潛在生物標志物。
Zhang S, Wu T, et al. Cancer Manag Res. 2017 Nov 23;9:691‐700.
目前CTC的應用主要在以下幾個方面：
1. 在常規(guī)手段無法對早期腫瘤進行判斷時進行輔助診斷。
2. 在伴隨診斷、療效評估方面，癌癥患者進行化療、靶向治療后進行CTC 檢測，若CTC 數量減少，提示治療方式可能有效。相比于現階段的檢查手段，CTC 檢測技術操作更方便，應用更簡單，可以更及時地提示醫(yī)生該患者是否適合化療或靶向治療。
3. 在術后監(jiān)測方面，主要是由于活檢無法高頻次檢測，而目前CTC 檢測在術后監(jiān)測中應用可能更方便，檢測頻次會更高。
循環(huán)腫瘤細胞（CTC）的特性
1. 稀有性：每10mL血液中可能僅含有幾個到幾十個循環(huán)腫瘤細胞。
2. 非典型性的細胞形態(tài)：一般比血液細胞，正常組織細胞體積大；細胞核大，不規(guī)則，細胞核質比高；不易發(fā)生變形。
3. 異質性：細胞表面抗原標志物表達差異，攜帶不同的分子信息，轉移潛力差異。
4. 不同類別：CTC可以是間質型、上皮型或者上皮間質混合型，CTC也既可以是單個細胞的CTC也可以是成團的CTCs(CTM)。
CTC富集和檢測方法
人體循環(huán)系統(tǒng)中CTC的含量極低,腫瘤轉移患者每毫升全血中僅有1～10 個CTC，因此要實現CTC的檢測對其進行分選富集是一個必不可少的步驟。CTC分選富集效果的優(yōu)劣將會直接影響其后續(xù)的檢測(計數、基因擴增、基因測序等)效果,因此高純度、高靈敏性(不丟失CTC)、快速、高細胞活性的CTC分選富集是CTC臨床應用的重點和難點。
CTC 的富集方法可以分為免疫親和富集法和物理特性富集法。免疫親和法主要是根據細胞表面表達的特異性的蛋白將CTC篩選出來，物理特性富集主要是根據CTC 的大小和密度等特性將這些細胞篩選出來。微流控芯片技術憑借多種優(yōu)勢已經在CTC富集分選中得到越來越廣泛的應用，有望在將來成為CTC富集和檢測工具之一。
利用免疫親和或物理特性法可富集到CTC，接下來還需要結合有效的下游分析方法。一方面，由于目前CTC捕獲技術不能保證百分之百的純度，需要對所得到的細胞進行鑒定，以進一步確定CTC細胞的數目，以減少CTC數目判定的假陽性率和假陰性率。另一方面，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，不僅CTC的數目在動態(tài)的變化，CTC所攜帶的分子標志物也在變化，通過對CTC表面標志物檢測，能夠反應腫瘤發(fā)生發(fā)展的動態(tài)變化，是研究腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的有效策略，并能很好地指導臨床治療。
常用的CTC檢測技術如免疫熒光、PCR、FISH及高通量測序等。
1. 免疫熒光法（IF）: 實體腫瘤細胞一般均為上皮來源，細胞內會表達角蛋(cytokeratin, CK)或其他腫瘤標示物(如HER2)。借助免疫熒光染色，可對來自實體瘤CTC中的瘤標進行識別，從而達到檢測CTC的目的。這也是目前檢測CTC的最常見方法。缺點是，在CTC形成過程的間質化(EMT)階段，大量的CK會降解，從而在CTC檢測過程中出現假陰性。
2. 熒光原位雜交（FISH）: 熒光原位雜交，是根據已知細胞內特異的DNA序列，以利用熒光標記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，與細胞內的基因組中DNA分子雜交，檢測該特異基因序列的存在與豐度。FISH技術與CTC結合，不僅可以檢測CTC表面標志物，也可以檢測CTC細胞內部的標志物及核型等。
3. RT-PCR，反轉錄PCR: 提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用引物和逆轉錄酶將mRNA反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數量級，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。結合RT-PCR可同時對若干個基因的表達進行檢測。位點特異性PCR技術可用于檢測CTC攜帶的驅動基因的突變情況。
4. 二代測序 : CTC數量少，直接進行二代測序難度大。需要將單細胞的DNA擴增后，再利用二代測序檢查基因序列。但是，目前單細胞測序的技術僅僅停留在實驗室階段，未來向市場推廣還有很長的路要走。而且由于腫瘤細胞的異質性，單細胞測序是否有代表性還需要更多的科學研究來證明。
CTC技術概述
