CTC富集的方法學(xué)

一、CTC 富集方法的分類和原理
 

CTC 的富集方法可以分為生物化學(xué)特性富集法（親和性富集法）和物理特性富集法。

親和性(生物特性)富集法主要是根據(jù)通過細(xì)胞表面特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物分離靶細(xì)胞，包括正向捕獲CTC 的陽性富集法和負(fù)向去除白細(xì)胞的陰性富集法。物理特性富集法主要是根據(jù)CTC 的大小、密度、力學(xué)和介電性能等物理特性將CTC 篩選出來。

二、CTC 富集技術(shù)的發(fā)展歷程和趨勢

2.1 發(fā)展歷程

從技術(shù)發(fā)展史來看，CTC 富集技術(shù)分為三代：第一代為基于物理特性的粗分離技術(shù)，第二代為基于生化特性的免疫磁珠技術(shù)，第三代為基于物理或生化特性的微流控芯片技術(shù)。

2.1.1 基于物理特性的粗分離技術(shù)

基于物理特性的粗分離技術(shù)通過特殊濾膜裝置、密度梯度離心將CTC 分離出來。這些技術(shù)操作簡單成本低廉，不依賴細(xì)胞表面抗原的表達(dá)，捕獲的細(xì)胞數(shù)量多，但是由于CTC 物理特性的異質(zhì)性，難以富集到高純度的CTC。

2.1.2 基于生化特性的免疫磁珠技術(shù)

基于生化特性的免疫磁珠技術(shù)通過免疫磁珠偶聯(lián)的抗體或多肽正向或負(fù)向篩選出CTC。由于技術(shù)的限制，早期的磁珠只能達(dá)到微米級。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在使用的磁珠大都為納米級，其增大的比表面積增加了與待測細(xì)胞的接觸幾率，更好的分散性降低了對細(xì)胞造成的機(jī)械性壓力，大大提高了CTC 的富集率。最典型的基于免疫磁珠富集CTC 的技術(shù)平臺是強(qiáng)生子公司veridex 的CellSearch，其是全球目前唯一同時經(jīng)過FDA 和CFDA 批準(zhǔn)的用于CTC檢測的商業(yè)化產(chǎn)品。該產(chǎn)品由于檢測靈敏度不高，且無法分離活體CTC，2016 年初已停產(chǎn)。除了CellSearch 之外，也有多種技術(shù)平臺基于免疫磁珠技術(shù)捕獲CTC，如AdnaGen 公司（已被Qiagen 收購）的AdnaTest，Miltenyi 公司的MACS，Illumina 公司的MagSweeper。

用于CTC 檢測的CellSearch 平臺。（A）將血液吸入含有EDTA 和細(xì)胞保護(hù)劑的CellSave 保護(hù)管中;（B）將7.5mL 血液轉(zhuǎn)移到單獨的管中并離心以分離固體血液成分和血漿;（C）樣品放入CELLTRACKS®AUTOPREP® 系統(tǒng)中，吸出血漿并將樣品重懸于緩沖液中（; D）添加偶聯(lián)EpCAM抗體的磁性納米顆粒并與EpCAM 陽性細(xì)胞結(jié)合，從而“富集”上皮來源的CTC。然后將磁珠結(jié)合的細(xì)胞與其他細(xì)胞通過磁性分離;（E）CTC 用CK8，CK18 和CK19 抗體染色。CD45 陽性染色細(xì)胞被認(rèn)為是白細(xì)胞，并被排除在分析之外;（F）應(yīng)用DAPI 染色細(xì)胞核;（G）施加磁力以分離磁珠結(jié)合的EpCAM 陽性細(xì)胞;（H）CK 陽性、DAPI 陽性、CD45 陰性的細(xì)胞被認(rèn)為是CTC 用于進(jìn)一步分析。

2.1.3 微流控芯片技術(shù)

微流控芯片技術(shù)基于CTC 的物理特性或生化特性或兩種特性的結(jié)合來富集CTC，所需樣品量小、流速可控而且能夠捕獲活細(xì)胞。微流控芯片技術(shù)目前已經(jīng)歷了三代的發(fā)展過程：第一代芯片為以CTC-Chip 為代表，第二代芯片以HB-Chip 為代表，第三代芯片以CTC-iChip 為代表。
微流微柱富集：該類芯片基于CTC 與血細(xì)胞生化特性的差異，在芯片中設(shè)置微柱陣列將其從血液中分離出來。此類芯片以CTC-Chip 為代表，該芯片是第一個使用微流體技術(shù)富集CTC的裝置。CTC-Chip 由78,000 個微柱陣列組成，微柱被識別EpCAM 的抗體包被，微柱的幾何排列和流體流速被優(yōu)化以促進(jìn)細(xì)胞附著到抗體包被的柱上。除了CTC-Chip，也有一些公司開發(fā)基于微柱結(jié)構(gòu)的芯片富集CTC，如Captura 公司的GEDI-Chip，Biocept 公司的OncoCEE?；谖⒅Y(jié)構(gòu)的芯片由于復(fù)雜的微柱設(shè)計很難在大規(guī)模的基礎(chǔ)上進(jìn)行高通量生產(chǎn)。此外，目前用于CTC 檢測和表征的技術(shù)嚴(yán)重依賴于免疫細(xì)胞化學(xué)和需要高分辨率成像的其他技術(shù)，這在非透明三維微柱陣列的存在下是困難的。

微流表面富集：由于基于微柱結(jié)構(gòu)的芯片的局限性，表面捕獲的微流體芯片被開發(fā)，這些芯片使用抗體包被的表面裝置捕獲CTC。表面捕獲裝置的簡化架構(gòu)更適合于大規(guī)模生產(chǎn)，并且還允許制造更易于成像的透明裝置。此類芯片以HB-Chip 為代表，其微流道的結(jié)構(gòu)為魚骨形（HB），表面被識別EpCAM 的抗體包被，血液流過一個可視通道，通道內(nèi)魚骨形溝回能夠引起血液的一個輕微斡旋，從而增強(qiáng)了其與抗體修飾表面的接觸。與第一代CTC 芯片相比，第二代的HB 芯片制作更為簡單，且可更高效地捕獲腫瘤細(xì)胞，捕獲效率約90%。后人在第二代的基礎(chǔ)上加上了aptamer（結(jié)合CTC 表面的EpCAM），進(jìn)一步提高了CTC 的捕獲效率。
除了HB-Chip，GEM-Chip、GO-Chip 以及BioFluidica 公司的ModularSinusoidal Microsystem 也都采用表面裝置捕獲CTC。使用表面捕獲裝置的一個挑戰(zhàn)是下游處理的靈活性，捕獲的CTC被固定在裝置的表面上，并且難以恢復(fù)以進(jìn)行進(jìn)一步分析。在胰蛋白酶消化后可以釋放在這些裝置中捕獲的細(xì)胞，然而胰蛋白酶很可能切割用于后續(xù)分析的許多感興趣的表面受體。
微流免疫磁珠富集：目前已經(jīng)有多家公司或研究單位應(yīng)用免疫磁珠技術(shù)來解決表面捕獲裝置的局限性，該技術(shù)能很好地控制細(xì)胞捕獲與釋放。此類芯片以CTC-iChip 為代表，該芯片將免疫磁珠和微流控技術(shù)結(jié)合起來用于CTC 富集。CTC-iChip 首先使用塑料微柱陣列將小個的紅細(xì)胞和血小板過濾出去，然后在磁場中通過“慣性聚焦”作用將較大的細(xì)胞排成一行，并使用陽性或陰性富集方法分離CTC 與白細(xì)胞。CTC-iChip 的捕獲效率可以高達(dá)98%，但是對于直徑較小（<8 微米）的CTC 并不適用。除了CTC-iChip，也有多種芯片技術(shù)使用免疫磁珠富集CTC。如Ephesia 公司的Ephesia，Cynvenio 公司的LiquidBiopsy，F(xiàn)luxion 公司的Isoflux，這些芯片的捕獲效率與第二代芯片相近，為90%左右。
上述芯片主要基于CTC 的生化特性將其從血液中分離出來，具有特異性高的優(yōu)點，能有效分選形狀、大小相似的不同種類細(xì)胞。目前大部分技術(shù)采用EpCAM 作為CTC 的表面特異性抗原，但是在不同的腫瘤亞型中，EpCAM 的表達(dá)各不相同。依賴EpCAM 的CTC 分選芯片會丟失不表達(dá)或低表達(dá)EpCAM 的CTC，然而這些CTC 具有更大的浸潤性和侵入性。因此，缺乏公認(rèn)的表面標(biāo)志物限制了親和性富集在CTC 分選中的應(yīng)用。

為了無需依賴表面標(biāo)志物，也有一些微流控芯片基于物理特性富集CTC，目前主要有基于細(xì)胞大小和變形性差異的芯片技術(shù)，基于細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)的芯片技術(shù)和基于細(xì)胞介電性質(zhì)的雙向電泳技術(shù)。
基于細(xì)胞大小和變形性差異的芯片技術(shù)：該技術(shù)通過在芯片內(nèi)部設(shè)計不同的小于CTC 直徑的微孔、微過濾網(wǎng)、微柱等結(jié)構(gòu)，當(dāng)含有CTC 的樣品流經(jīng)芯片時，CTC 由于直徑大而被卡在結(jié)構(gòu)內(nèi)，血細(xì)胞則隨緩沖液一起流出，較大的白細(xì)胞被結(jié)構(gòu)捕獲時，由于CTC 比白細(xì)胞變形性小，加大緩沖液流速時，白細(xì)胞被沖走，CTC 則留在芯片內(nèi)，從而達(dá)到分離目的。Abnova公司的ClearCell®CXSystem 就是基于此原理分離CTC 的代表，該系統(tǒng)還可以動態(tài)監(jiān)測CTC 的捕獲過程。芯片主要結(jié)構(gòu)由圓柱形微柱構(gòu)成，每個捕獲單元由三個圓柱排列組成一個“爪形”結(jié)構(gòu)。
基于細(xì)胞大小和變形性差異分選CTC 的優(yōu)勢在于：操作過程簡單，捕獲效率高，能夠?qū)崿F(xiàn)高通量富集，成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于CellSearch，無需依賴表面標(biāo)志物，分選出的CTC 可以用多種抗體進(jìn)行標(biāo)志物鑒別。該方法存在的問題是僅僅基于細(xì)胞尺寸和變形性不同而進(jìn)行過濾式分選，由于CTC 尺寸和白細(xì)胞有重疊部分，CTC 有可能會通過濾網(wǎng)或微柱的間隔；而且在較大的機(jī)械力作用下，CTC 隨著緩沖液流過微柱或者濾網(wǎng)時容易破裂。這些因素會對分離純度和細(xì)胞活性造成一定影響，這類芯片在設(shè)計內(nèi)部捕獲單元時應(yīng)避免使用帶棱角的微柱，比如三角形、長方形、正方形等。
基于細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)的芯片技術(shù)：這些技術(shù)主要基于慣性力或確定性側(cè)向位移。基于慣性力的慣性微流技術(shù)通過使用兩種力（梯度剪切升力和管壁效應(yīng)升力）在微流體裝置中應(yīng)用慣性效應(yīng)，基于尺寸被動地將CTC 與其他血細(xì)胞分離。這些升力的大小和方向取決于通道尺寸，通道縱橫比，流速和顆粒直徑。目前該技術(shù)的商業(yè)化平臺主要有Vortex（直線型通道）和ClearCellFX（單螺旋通道）。
基于確定性側(cè)向位移設(shè)計的微流控芯片原理是芯片內(nèi)具有相對于流體流動方向呈一定角度的微柱陣列，尺寸不同的顆粒在流動過程中具有不同的運動軌跡，尺寸大的顆粒會發(fā)生側(cè)向位移向一側(cè)匯聚，尺寸小的顆粒會按原軌跡運動，在芯片上設(shè)計相應(yīng)的兩個出口，即可收集到相應(yīng)的細(xì)胞。
基于細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)差異分選同基于細(xì)胞大小和變形性差異分選一樣，裝置簡單、無需復(fù)雜的實驗設(shè)備、成本低。樣品無需標(biāo)記，不影響CTC 分子特性和表面標(biāo)志物；細(xì)胞在微流環(huán)境中損傷小，分選后細(xì)胞的存活率更高，可繼續(xù)培養(yǎng)和做后續(xù)分析。然而，由于血液的復(fù)雜性，細(xì)胞間的相互作用不容易控制，當(dāng)處理細(xì)胞濃度較高的樣品時，分選效率降低。另外，該方法單純基于細(xì)胞的物理特性實現(xiàn)，而人體血液是高度復(fù)雜的血漿、紅白細(xì)胞、血小板、蛋白質(zhì)混合物，且血液黏度是水的3 倍以上，因此芯片有時容易發(fā)生堵塞現(xiàn)象，影響分選效率，分選出的CTCs 可能存在假陽性結(jié)果。
基于細(xì)胞介電性質(zhì)的雙向電泳技術(shù)：雙向電泳（DEP）是微流控芯片上一種常用的細(xì)胞分選方法，其原理是不同類型的細(xì)胞在電場中介電性質(zhì)不同，所受介電力的大小和方向不同，在不同介電力作用下向不同方向移動，在電場中實現(xiàn)目的細(xì)胞的分選。目前，商業(yè)化的雙向電泳技術(shù)主要有ApoCell 公司的ApoStream，SiliconBiosystems 公司的DEPArray。

雙向電泳法最大的優(yōu)勢是可將不同癌種表面標(biāo)志物表達(dá)相同、尺寸相似、形態(tài)相似的細(xì)胞分離出來。但是在較大的流速下，微弱的電泳力沒有充足時間感應(yīng)流過的CTC，從而難以達(dá)到快速分選。該方法存在的另一個問題是電場力可能會對細(xì)胞活性和表面特性產(chǎn)生影響，不利于對CTC 進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)和分子特性分析。雙向電泳法分選時間長，但準(zhǔn)確率高，因此，較適合于少量細(xì)胞的分選。

CTC 富集技術(shù)的發(fā)展歷程

2.2 發(fā)展趨勢

2.2.1 微流控芯片技術(shù)有望得到更廣泛應(yīng)用

微流控芯片技術(shù)由于其自身特點在細(xì)胞分選方面具有一定的優(yōu)勢，包括芯片體積小、速度快、通量高、操作簡便、樣品和試劑消耗低、易在芯片上集成多用途功能部件等．經(jīng)過十多年的發(fā)展，該技術(shù)已經(jīng)在CTC 分選中越來越廣泛的應(yīng)用，有望在將來成為CTC 富集和檢測工具之一。該技術(shù)目前也面臨著一些技術(shù)上和臨床上的挑戰(zhàn)：芯片通道空間小，實驗過程中管道容易被堵塞；有些特殊的芯片造價昂貴不便于推廣應(yīng)用；在進(jìn)行細(xì)胞分選時，有些方法難以確保較高的細(xì)胞活性；缺乏統(tǒng)一的CTC 表面標(biāo)志物等．如何改進(jìn)微流控芯片技術(shù)在進(jìn)行細(xì)胞分選時所遇到的上述問題，充分發(fā)揮其優(yōu)勢，將是接下來研究的關(guān)鍵。

2.2.2 開發(fā)納米技術(shù)和適配體在微流控芯片中的應(yīng)用

CTC 檢測的靈敏度和可靠性非常重要，7.5ml 血液中有1～5 個CTC 在臨床上都是有意義的，假陰性和假陽性都可能對樣品分析、臨床診斷產(chǎn)生重要影響。隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展，功能化納米材料修飾的微流控芯片廣泛應(yīng)用于CTC 的富集和檢測?？贵w連接的功能性納米粒子能夠為CTC 與抗體的結(jié)合提供更大的接觸表面積，因此納米技術(shù)也成為細(xì)胞分選中備受矚目的一項新技術(shù)。適配體能提供特異性CTC 靶點，因此微流控芯片的應(yīng)用也許可以向基于新的CTC 捕獲探針（如核酸適配體探針等）方面發(fā)展，尋找特異性強(qiáng)的適配體探針，以提高CTC檢測的可靠性。

2.2.3 基于多種捕獲方法設(shè)計微流控芯片

親和性富集法特異性高，能有效分選形狀、大小相似的不同種類細(xì)胞，但是陽性富集法大都使用EpCAM，會丟失不表達(dá)或低表達(dá)EpCAM 的CTC，而陰性富集法只是去除了白細(xì)胞，CTC純度不高。物理特性富集法不依賴細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)，捕獲的細(xì)胞數(shù)量多，能夠克服CTC 在蛋白表達(dá)上的異質(zhì)性，但是無法克服CTC 在物理特性的異質(zhì)性。因此，采用多種捕獲方法相結(jié)合，充分利用各自的優(yōu)點設(shè)計CTC 捕獲微流控芯片是將來的發(fā)展趨勢。如第三代芯片CTC-iChip，其利用確定性側(cè)向位移、慣性聚焦和免疫磁珠富集CTC。

1.1 親和性富集法

親和性富集法根據(jù)結(jié)合的靶細(xì)胞是CTC 還是白細(xì)胞，可分為陽性富集法和陰性富集法。

陽性富集法主要利用特異性抗體與腫瘤細(xì)胞表面抗原進(jìn)行特異性結(jié)合來富集CTC。CTC 分為上皮細(xì)胞表型、間質(zhì)細(xì)胞表型和上皮間質(zhì)細(xì)胞混合表型，因此用于CTC 陽性富集的特異性抗體分為識別上皮標(biāo)志物、識別間質(zhì)標(biāo)志物和識別上皮間質(zhì)標(biāo)志物三種。其中，上皮標(biāo)志物在正常上皮細(xì)胞和上皮腫瘤（即癌）上表達(dá)，但在間質(zhì)白細(xì)胞上不存在，因此經(jīng)常用于區(qū)分癌細(xì)胞和正常血細(xì)胞。上皮細(xì)胞粘附分子（EpCAM）是最常用于上皮表型CTC 陽性富集的細(xì)胞表面標(biāo)志物。此外，由于細(xì)胞骨架蛋白對于上皮細(xì)胞具有特異性，細(xì)胞角蛋白家族成員（即CK8，CK18 和CK19）已經(jīng)成為檢測具有上皮表型癌癥患者CTC 的“金標(biāo)準(zhǔn)”標(biāo)記物。

陰性富集法也稱白細(xì)胞去除法，通常用識別CD45 或CD14 的特異性抗體與白細(xì)胞結(jié)合，從而去除全血中的白細(xì)胞。

除了特異性抗體，親和性結(jié)富集法的某些技術(shù)采用與CTC 或白細(xì)胞表面抗原特異性結(jié)合的多肽或適配體（aptamer，一種單鏈DNA 或RNA 分子，與目的蛋白有很高的親和力和特異性）替代抗體來實現(xiàn)陽性或陰性富集。

1.1.1 免疫磁珠技術(shù)

親和性富集法目前基于免疫磁珠技術(shù)和微流控芯片技術(shù)對CTC 進(jìn)行富集。免疫磁珠技術(shù)是根據(jù)免疫親和的原理，將免疫磁珠與捕獲抗體或特異性多肽（可與血液中的CTC 或白細(xì)胞表面抗原相結(jié)合）相連接，隨后通過磁場即可將磁珠捕獲與未捕獲的細(xì)胞分離。

1.1.2 微流控芯片技術(shù)

微流控（microfluidics）是一種精確控制和操控微尺度流體，以在微納米尺度空間中對流體進(jìn)行操控為主要特征的科學(xué)技術(shù)。微流控芯片是微流控技術(shù)實現(xiàn)的主要平臺和技術(shù)裝置，因其樣品量小、流速可控及構(gòu)件透明性等特點，已被廣泛應(yīng)用于CTC 的分選富集中。微流體芯片技術(shù)基于親和性富集法分離CTC 時，芯片內(nèi)部的微通道或微結(jié)構(gòu)上修飾能夠與CTC 或白細(xì)胞表面抗原結(jié)合的特異性抗體或適配體，當(dāng)血液流經(jīng)芯片時，特異性抗體或適配體可與目的細(xì)胞表面抗原結(jié)合，隨后將CTC 或白細(xì)胞粘附在芯片上，實現(xiàn)CTC 的陽性捕獲或陰性富集。

1.2 物理特性富集法

物理特性富集法根據(jù)物理性質(zhì)來分離CTC，包括大小、密度、力學(xué)和介電性質(zhì)。從大小上來看，CTC 的直徑約為10-20μm，而血細(xì)胞大小為7-12μm，通過過濾可留下體積較大的CTC。從密度上來看，CTC 的密度較白細(xì)胞和紅細(xì)胞密度小，通過密度梯度離心可實現(xiàn)CTC 分離。除了大小和密度的差異，一些技術(shù)也利用CTC 和血細(xì)胞之間的力學(xué)和介電性質(zhì)差異來捕獲CTC。具體來說，CTC 的可變形性不及血細(xì)胞。另外，CTC 的膜電容通常較血細(xì)胞低，在一定強(qiáng)度的電場中，其遷移率與血細(xì)胞會產(chǎn)生差異。微流控技術(shù)除了在親和性富集法中有廣泛應(yīng)用外，在物理特性富集法中也有應(yīng)用。微流控芯片根據(jù)CTC 與血細(xì)胞物理特性的差異，通過在芯片中設(shè)置不同的微結(jié)構(gòu)單元將其從血液中分離出來，常用的微結(jié)構(gòu)包括微孔、微過濾網(wǎng)和微柱等。

1.3 生化和物理特性相結(jié)合的方法

此外，也有一些技術(shù)將CTC 的物理和生物化學(xué)特性結(jié)合起來用于CTC 富集。如CTC-iChip，其基于CTC 大小和表面標(biāo)志物的表達(dá)情況進(jìn)行CTC 富集。該技術(shù)首先根據(jù)細(xì)胞大小，將較小的紅細(xì)胞和血小板過濾出去，留下白細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。然后，用識別EpCAM 的磁珠偶聯(lián)抗體對CTC 進(jìn)行免疫染色，在磁場中捕獲并收集在芯片上。或者用識別CD45 的磁珠偶聯(lián)抗體去除白細(xì)胞后收集CTC